Brief introduction of Lunguide,a targeted delivery platform.
核酸药物是继小分子药物和抗体药物后的第三大类药物。与后两者靶向蛋白质的机制不同，核酸药物根据其核酸序列，可在患者体内表达，编辑、激活或沉默某种或某些特定基因，以达到治疗疾病的目的，因此可用于治疗“不可成药靶点”相关的疾病。由于核酸分子具有高分子量，高负电荷，强亲水性以及低理化稳定性等特点，难以直接用于疾病治疗。核酸递送载体，如聚合物纳米颗粒，腺病毒载体，脂质纳米颗粒等应运而生。其中，脂质纳米颗粒是目前临床上最先进的核酸递送系统，和其他递送系统相比其优势包括制备简单、生物相容性高和易于修饰等优点。两款mRNA-LNP类型的 SARS-COV-2疫苗在抗击新型冠状病毒疫情中发挥了巨大作用，使LNP和核酸药物受到广泛关注。由于LNP经静脉给药容易在肝脏积聚，现阶段LNP递送系统大多是肝脏靶向的，肝脏以外器官（如肺和脾）的靶向递送是核酸药物开发过程中亟待解决的问题。
肺是人体控制呼吸和肺循环的关键器官。肺部相关的疾病，如肺纤维化和肺癌，是造成人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织的数据显示，肺癌是全球每年造成死亡人数最多的癌症，仅2020年就导致全球范围内180万人死亡。药物的肺部靶向递送，对于提高肺部相关疾病治疗指数和患者生存率具有重要意义。鉴于静脉血在肺部的首过效应以及肺血管内皮细胞表面积较大的特点，调节LNP的理化趋向性，经静脉给药可能比其他给药方式更容易实现核酸药物的肺靶向递送。
2020年，Daniel Siegwart团队报道了选择性器官靶向(SORT)递送技术，将阳离子脂质DOTAP作为第五种成分，加入5A2-SC8/DOPE/DMG-PEG2000/Cholesterol中制备LNP，改变LNP的电位等理化性质，进而影响LNP血液循环过程中蛋白冠的形成，实现经静脉注射将mRNA递送至肺部1。后续多个研究团队采用类似策略实现核酸的肺部靶向递送2, 3。Daneil Siegwart团队最近发表在Science上的论文报道了Lung SORT LNP用于递送ABE mRNA/sgRNA，对肺部干细胞进行基因编辑，治疗肺囊性纤维化4。2021年，Virgil Percec团队报道了单一组分的两亲性可离子化树枝分子(IAJD)制备的DNP将mRNA靶向递送至肺部5。2022年，Qiaobing Xu团队报道了基于可离子化脂质306-N16B的LNP，实现mRNA的肺内皮细胞靶向递送，可离子化脂质的氨基头部可能是实现肺部靶向递送的关键6（结构式见图一）。然而，含阳离子脂质的肺靶向LNP经静脉注射后，会引发纤维蛋白原附着在LNP表面以及血小板活化，最终导致血栓的产生7。可能由于该类副作用，越来越多的研究团队采用LNP的雾化吸入策略开发肺部疾病的核酸治疗方法，如Arcturus即将开展一期临床试验的mRNA药物ARCT-032，即通过雾化吸入给药方式治疗肺囊性纤维化。但是雾化给药具有一定操作门槛，操作不当可能引起呼吸道病变或黏膜损伤。厚存纳米药业的具有自主知识产权的肺靶向LNP基于自研可离子化脂质，无需加入第五种阳离子脂质，经静脉注射给药，可实现mRNA、circRNA和siRNA等核酸的高效肺靶向递送，同时其毒性较低。
图一、用于肺靶向LNP制备的阳离子脂质和可离子化脂质结构式示例
LLNP可离子化脂质库
厚存纳米采用组合化学策略自主研发了庞大的可离子化脂质化合物库，命名为LLNP。在制备LNP过程中，这些可离子化脂质可以与核酸的磷酸二酯键骨架通过正负电荷作用以及氢键等作用力实现对核酸的高效包载。通过变换连接键和引入支链等策略，我们可以调节所制备的LNP的理化性质和生物分布，实现LNP的器官靶向递送。
Lunguide®系列可离子化脂质
由于in vitro和in vivo实验数据的相关性较低，我们采用in vivo高通量筛选方法对LLNP进行筛选。Lunguide®系列脂质是我们自主研发LLNP中的一类肺靶向可离子化脂质，Lunguide® LNP可以实现Fluc mRNA以及Fluc circRNA的肺靶向递送，肺部荧光素酶表达占比分别高达98%（图二）和95%（图三），该系列部分脂质可以实现肺部99%的转染占比。
图二、经静脉注射Lunguide LNP实现Fluc mRNA的小鼠肺靶向递送
图三、经静脉注射Lunguide LNP实现Fluc circRNA的小鼠肺靶向递送
Fluc mRNA-Lunguide LNP表征
我们还检测了Fluc mRNA-Lunguide LNP的理化性质，包括粒径，Zeta电位和包封率等。 通过调节可离子化脂质、磷脂、胆固醇以及PEG脂质四种组分的比例，Lunguide LNP具备可接受的纳米颗粒尺寸(120 nm)且粒径均一，其总电荷约为 10 mV，Fluc mRNA包封率高达99%。（表一）
表一、Fluc mRNA-Lunguide LNP优处方的表征
Lunguide LNP的生物分布
随后，我们用Lunguide LNP递送Cy5-siRNA来确定Lunguide LNP的生物分布。每只小鼠静脉注射6 μg Cy5-siRNA，10 min后IVIS成像结果显示，LNP可将89%的Cy5-siRNA递送到肺部。在一定程度上表明，Lunguide LNP本身的肺部趋向性是其实现肺部转染的主要原因（图四）。
图四、经静脉注射Cy5-siRNA-Lunguide LNP后Cy5-siRNA的生物分布
Lunguide LNP转染的肺部细胞类型测定
单细胞测序（scRNA-seq）技术可以实现不同细胞类型的精细区分，从而精准量化细胞水平的mRNA递送。基于对样本细胞的构成信息，我们根据细胞的marker gene对细胞亚群进行判定和分类（图五）。如图六所示，按照目标基因在细胞中的表达高低进行着色，其中灰色表示目标基因在该细胞中不表达或表达量比较低，红色代表目标基因在该细胞中表达，且颜色越深表达量越高。表明Lunguide LNP-Fluc mRNA可以在肺泡巨噬细胞和毛细血管内皮细胞-气质胶质细胞高效转染。显示出Lunguide LNP在肺部CAR-M细胞疗法（巨噬细胞靶向）以及肺癌治疗（内皮细胞靶向）等场景中的应用潜力。
图五、不同细胞标志基因的表达特征图
图六、单细胞测序聚类分析结果。B：B细胞；Alv Mf：肺泡巨噬细胞；aCap：毛细血管内皮细胞 - 气质胶质细胞；Neut：中性粒细胞；Col13a1_fibroblast：Col13a1+成纤维细胞；CD4：CD4阳性T细胞；NK：自然杀伤细胞；Mono：单核细胞；CD8：CD8阳性T细胞；Int Mf：间质巨噬细胞；DC1：树突状细胞；pro-B：B细胞祖细胞；AT2：肺泡2型细胞；Clara：纤毛细胞；Pericyte：周皮细胞-外膜细胞；Plasma：浆细胞；ILC2：先天性淋巴细胞2；AT1：肺泡1型细胞；Mesothelial：间皮细胞；Lymph：淋巴内皮细胞；pDC：浆细胞样树突状细胞。
Lunguide LNP可实现siRNA和mRNA肺靶向共递送
我们还发现，Lunguide LNP在保持较高的肺靶向性的前提下，可实现Cy5-siRNA和Fluc mRNA的共递送（图七）。siRNA和mRNA的肺靶向共递送为不同类型的核酸药物协同治疗肺部疾病奠定了坚实的基础。
图七、Lunguide LNP实现siRNA和mRNA的小鼠肺靶向共递送
Lunguide LNP的安全性和稳定性
小鼠经静脉注射含15 μg Fluc mRNA的肺靶向LNP，3 h后，组织病理学实验结果显示，小鼠主要器官无明显损伤，显示出我们的肺靶向LNP安全低毒的优点（图八）。我们正在进行的给药剂量为10 mg/Kg的急性毒性评价试验也进一步验证了其低毒性。LNP的稳定性对药物的储存运输、药物的有效性以及患者的用药安全非常重要。4 °C、-20 °C或-80 °C条件下储存一年，Lunguide LNP的粒径、PDI和电位变化较小，显示出其出色的稳定性（图九）。
图八、静脉注射给药3 h后小鼠主要器官的组织学分析
图九、Fluc mRNA-Lunguide LNP的储存稳定性数据
Lunguide LNP可实现Fluc mRNA的兔肺靶向递送
我们还以兔子为实验对象探究Lunguide LNP的肺靶向性是否存在种属差异。结果显示，经静脉注射给药，Lunguide LNP可以高选择性地将Fluc mRNA递送到肺部，肺部转染占比高达85%（图十）。这也增强了我们以灵长类动物为实验对象，对Lunguide LNP进行进一步研究的信心。
图十、经静脉注射Lunguide LNP实现Fluc mRNA的兔肺靶向递送
厚存纳米的目标是为客户提供安全可靠的核酸递送整体解决方案，LLNP可离子化脂质库为肝脏以外的器官靶向递送提供了选择，我们Lunguide®递送平台下一步的研发方向是肺部功能性细胞的精准递送。此外，厚存纳米肺靶向试剂盒的研发工作正在如火如荼地进行中，敬请期待。总之，Lunguide LNP是一个高效、稳定且安全的核酸递送系统，可达到99%的mRNA包封率以及99%的肺部转染占比。它在肺部疾病核酸药物开发方面极具应用潜力，可能的应用场景包括肺部CAR-M细胞疗法、肺癌、肺囊性纤维化和病毒性肺炎等。
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厚存纳米简介：公司成立于2018年11月28日，是国内较早专注于mRNA药物纳米递送载体新材料、新制剂、新剂型、新设备开发的企业。mRNA药物的应用前景十分广阔，与现有药物相比，在药效和成本方面更具优势，然而由于专利壁垒与系统工艺的问题，其市场化应用受到了极大的挑战。厚存纳米响应市场的需求，通过自主创新开发了TARGETAI、LLLRNA、BMPNP、LONGENE、GENEFREI、LUNGUIDE等纳米递送技术，经过五年的执着和努力，成功实现了肝靶向、肺靶向、脾靶向、淋巴结靶向技术的突破，目前正在开发第一代脂肪组织靶向、第二代肺靶向及第三代脾靶向载体。本公司递送技术可用于mRNA预防疫苗、mRNA肿瘤疫苗、CAR-T疗法、siRNA疗法、多肽/蛋白替代疗法、基因编辑、罕见病等多种核酸药物开发。目前已提交30多项专利申请，其中已授权23项，并与国内外多个单位建立了合作关系。公司分别在2021年和2022年被《中国疫苗白皮书》和《RNA疗法行业白皮书》收录，2022年入选“科创中国”生物医药领域先导技术榜单、深圳光明区首批授牌认定的合成生物企业，2023年获得深圳市创新型中小企业认定。公司核心团队来自国内外知名高校，具有深厚的技术背景和知识储备。目前公司资金雄厚，已具备市场化能力，欢迎投资伙伴洽谈投融资合作。2024年厚存纳米将加快迈向市场的步伐，为高质量客户带来最佳的合作体验。
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